一般我们购买商品化的primary antibody的时候，抗体的说明书中都会给我们一个推荐的抗体使用浓度。这个浓度在一定程度上来说，是过饱和的，可以满足大多数实验的染色需求。

但是因为是过饱和的浓度，这就带来了一定程度的抗体浪费。而过量的抗体，也会大大提高样本的自发荧光。

从另一个角度来看，因为厂家给出的推荐浓度都是基于一个特定的样本浓度和样本体积，所以在一些特殊的实验中，比如样本浓度或样本体积过大的实验，推荐的浓度就无法达到饱和滴加的要求。在这样的前提下，推荐实验用户针对自己的实验要求，zui好可以对抗体进行滴定。节约成本的同时，也可以让自己的实验更加。

滴定的原则：

1. 在进行滴定实验前，应该遵守一个实验一个变量的原则。既然滴定实验要求的是摸索出准确的抗体工作浓度，那在制作样本前，也需要对其他的实验条件进行统一。而这些在滴定实验中的条件，也应该沿用到后续的正式实验中去。

2. 需要统一的条件：样本，样本数量/管，样本体积/管，孵育条件等。总的来说，一个成功的滴定实验，只应该有“抗体的终浓度不同”这一个实验中的变量。

3. 滴定的稀释倍数：一般按照5倍稀释的标准做5个梯度的原则做滴定实验。也可根据自己的实验进行适当调整。起点浓度的选择则需要按照具体的实验进行分析。比如，对于PBMC或者裂解后的全血、脾脏之类的样本，活细胞比例高，单管样本一般以1*10^6为上限。可以从推荐用量开始，往下5倍稀释，做5个梯度。但是有些原代细胞，比如涉及肿瘤免疫方面的样本，活细胞比例低，免疫细胞的浸润比例低，所以制备的样本数量也会比较大，这个时候，也可以选择超过推荐的浓度滴加，然后再进行梯度稀释。

4. 滴定实验完成后，通过计算染色指数（stain Index）确定zui佳抗体浓度。染色指数公式如下：

示例：

我们以anti-human CD3抗体举例：在100ul全血样本中，我们以该抗体推荐的用量5ul/tube 为高浓度，5倍稀释，并设置5个梯度。高浓度至低浓度分别是5ul/100ul blood，1ul/100ul blood，0.2ul/100ul blood，0.04ul/100ul blood，0.008ul/100ul blood。通过计算，染色指数由高浓度到低分别为98.57，106.29，96.97，12.36，8.58。从染色指数上看，我们挑选出zui优的抗体浓度为1ul/100ul blood。即为推荐用量的1/5。

用第三方软件进行数据叠加可以一目了然。

注意事项：

1. 对于一些阳性表达几乎100%的细胞，比如PBMC中的CD45,可以在样本染色后少量加入未染色的细胞。

2. 对于表达量比较少的稀有细胞群体，在染色时，可加入该群细胞的父级细胞群的抗体。在设计多色实验的滴定时，zui好可以分批滴定。将表达量高的抗体先进行滴定。确定zui佳浓度后，再滴定表达量少的抗体，并将已经滴定好的抗体一同加入。比如我们在滴定外周血中的foxp3时，zui好可以加入已经确定好浓度的CD4抗体。

3. 对于消化的组织来说，因为存在大量的死细胞，所以在这些样本的滴定过程中，要先加入死活染料区分死活，再确定目标抗体的浓度。

4. 是否需要在滴定前blocking？取决于正式实验。如果正式实验是封闭的，那么滴定实验也需要。

5. 遇到不同厂家，不同货号，不同克隆号的抗体，需要重新滴定。

6. 滴定完成后，理论上只要cat号一致，lot号不一致，不需要重新滴定。但是为了保险起见，每一瓶抗体，特别是不同lot的抗体，zui好留一个样本的抗体量，以方便日后的QC或者实验复盘。